Metode de Separare și Analiză a Acidului Folic

Generalităţi

Acidul folic este o vitamină hidrosolubilă de care organismul are nevoie pentru a produce eritrocite, leucocite, trombocite, ADN şi pentru o creştere sănătoasă. Se găseşte în principal în cereale întregi si legume cu frunze verzi. De asemenea joacă un rol important in perioada din timpul sarcinii.

Acidul folic se numeşte astfel deoarece a fost izolat prima dată din frunzele plantelor (folium-frunza). Se mai numeşte şi acid pteroilglutamic, denumire ce provine din structura sa chimică. Grupul generic al “acizilor folici” este constituit dintr-un complex de vitamine B, care din punct de vedere chimic sunt corelate cu acidul pteroilglutamic, au acţiune hematopoetică şi leucopoetică, dar se deosebesc între ele prin acţiunea specifică pe care o au asupra diferitelor microorganisme şi specii de animale.

Acidul folic are o structură complexă, având molecula compusă din trei fragmente:

-un inel pteridinic pe care se găseşte grefată o grupare amino în pozitia 2 şi o grupare hidroxil în poziţia 4 (2-amino-4-hidroxipteridina);

-un radical al acidului para-amino-benzoic (PABA);

-un rest peptidic rezultat din una sau mai multe (până la 7) molecule de acid glutamic.

Primele două componente constituie acidul pteroic. Prin adăugarea la acesta a celui de-al treilea component (un rest de acid glutamic), se obţine acidul pteroil-mono-glutamic (Pte-Glu), derivat la care ne referim atunci când folosim denumirea de acid folic.

Structura chimică a acidului folic s-a stabilit iniţial prin identificarea compuşilor ce rezultă din degradarea sa hidrolitică, în mediul alcalin aerob. În aceste condiţii din acidul folic s-a obţinut o fracţiune cu funcţie aminică aromatică primară, din care prin hidroliza ulterioară se eliberează acidul paraaminobenzoic şi acidul glutamic.

A doua fracţiune avea structură pteridinică, era fluorescentă şi prezenta caracter acid. [1]

Stuctura chimică a acidului folic

Analiza cromatografiei lichidă de înaltă performanță pentru acid folic

Scopul cromatografiei de lichide de înaltă performanță este de a separa componentele de interes într-un timp rezonabil în benzi separate de vârf în momentul când acestea migrează prin coloană.

Metodă şi materiale.Reactivi

Au fost folosite următoarele materiale și reactivi: acid folic și acid folinic (sare de calciu) acid ascorbic, ascorbat de sodiu, hidrogen fosfat de dipotasiu (K2HP04), acid fosforic, 2-mercaptoetanol, metanol și acetonitril. Apa pură chimic a fost filtrată printr-un filtru de 0.45 µm folosită pentru a pregăti soluțiile tampon, soluția a fost apoi filtrată din nou. Solvenții (metanol, acetonitril) și soluțiile tampon au fost, de asemenea, degazate prin sonificare înainte de a fi pompate în sistemul HPLC.

Metoda adaptată a fost utilizată pentru prepararea acidului folic și acid folinic standard, în care acidul folic (0.0lg), acid folinic (0,01 g) au fost dizolvate în 100 ml 0,2M2-mercaptoetanol conținând ascorbat de sodiu 0,1% pentru al proteja de descompunerea oxidativă. Materialele au fost înghețate la – 20 C°, și protejate de lumină până în momentul utilizării.

Faza mobilă cuprinde tampon și metanol, în diferite proporții. Soluția tampon este formată din tampon de fosfat citrat (0,1 M, pH 4.0), ajustat cu acid fosforic: Acid acetic 1%: metanol (43:42: 15). Detecția a fost stabilită la 250 nm și 280 nm. Acidul folic și folinic soluțiile standard de acid au fost filtrate prin filtre de nylon Whatman (0,45 µm) înainte de a fi injectate în coloană. În scopul de a identifica raportul, care va oferi cea mai bună rezolutie. Faza mobilă a fost schimbată în raporturi diferite de 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10 tampon:metanol. Condițiile cromatografice de mai sus au fost, de asemenea folosite cu detecţie fluorescentă în care lungimea de undă a fost stabilită la 360 nm și 460 nm pentru excitare respectiv pentru emisie.

Gradient de eluare

Standardele au fost întocmite în conformitate cu o metodă în care acidul folic (0,01 g) și acid folinic (0.0lg) au fost dizolvate separat în l00mL de fosfat tampon (0,1 M; pH 7,0 ajustat folosind acid fosforic) conținând 0,1% (v / v) 2mercaptoethanol. Detaliile de eluţie ale gradientului sunt indicate în tabelul 1.